CRISPR-Cas9의 구조와 유전자 편집 원리

1. CRISPR-Cas9이란?

CRISPR-Cas9은 가이드 RNA(Guide RNA)를 이용하여 특정 DNA 염기서열을 인식하고 절단하는 유전체 편집(Genome editing) 기술이다.

CRISPR는 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats의 약자로, 규칙적인 간격으로 배열된 짧은 회문 반복 서열을 의미한다.

Cas9은 CRISPR-associated protein 9의 약자로, 특정 DNA를 절단하는 핵산분해효소(Endonuclease)이다.

CRISPR-Cas9 시스템은 원래 세균과 고세균에서 발견되는 CRISPR-Cas 면역 체계에서 유래하였다.

이 시스템은 바이러스나 외래 유전물질의 염기서열 정보를 이용하여 외래 핵산을 인식하고 제거하는 적응성 방어 기작으로 작용한다.

연구자들은 이러한 원리를 이용하여 원하는 DNA 염기서열을 선택적으로 절단하는 유전체 편집 기술을 개발하였다.

CRISPR-Cas9의 주요 특징은 다음과 같다.

• 가이드 RNA의 염기서열을 이용한 표적 DNA 인식
• Cas9 단백질에 의한 DNA 이중가닥 절단
• 세포의 DNA 복구 기작을 이용한 유전체 변형
• 특정 유전자의 기능 제거 또는 변화
• 유전자 발현 조절 및 유전 질환 연구에 활용
• 다양한 세포와 생물종에 적용 가능

다만 CRISPR-Cas9이 표적 DNA를 절단한다는 사실과 원하는 유전체 편집 결과가 반드시 생성된다는 것은 서로 다른 의미이다.

실제 편집 결과는 DNA 복구 경로와 세포의 상태에 따라 달라진다.

2. CRISPR-Cas9의 발견과 연구 역사

CRISPR 서열은 세균 유전체에서 반복적으로 나타나는 특이한 DNA 구조를 연구하는 과정에서 발견되었다.

이후 CRISPR 서열 사이에 존재하는 스페이서(Spacer) DNA가 바이러스나 플라스미드 등 외래 유전물질의 염기서열과 관련되어 있다는 사실이 밝혀졌다.

이러한 발견은 CRISPR-Cas 시스템이 세균의 면역 체계로 작용한다는 이해로 이어졌다.

2012년 Jennifer Doudna와 Emmanuelle Charpentier 등의 연구진은 Cas9과 RNA를 이용하여 특정 DNA를 절단할 수 있음을 실험적으로 제시하였다.

이후 CRISPR-Cas9 기술은 진핵세포의 유전체 편집에도 활용되기 시작하였다.

Jennifer Doudna와 Emmanuelle Charpentier는 유전체 편집 방법의 개발에 기여한 공로로 2020년 노벨 화학상을 수상하였다.

현재 CRISPR-Cas9은 기초 생명과학 연구, 유전자 기능 분석, 작물 개발 및 유전자 치료 연구에 널리 활용되고 있다.

3. 세균의 CRISPR-Cas 면역 체계

세균의 CRISPR-Cas 면역 체계는 일반적으로 적응(Acquisition), 발현 및 가공(Expression and processing), 간섭(Interference)의 단계로 설명할 수 있다.

3.1 1단계: 외래 DNA의 침입

박테리오파지와 같은 바이러스가 세균에 감염되면 외래 DNA가 세균 내부로 유입될 수 있다.

세균의 CRISPR-Cas 시스템은 이러한 외래 유전물질에 대응하는 방어 기작으로 작용한다.

3.2 2단계: 스페이서 획득

일부 CRISPR-Cas 시스템에서는 Cas1과 Cas2 등의 단백질이 외래 DNA에서 유래한 짧은 염기서열을 CRISPR 배열에 삽입한다.

이렇게 삽입된 서열을 스페이서(Spacer)라고 한다.

스페이서는 과거에 침입한 외래 유전물질의 염기서열 정보를 보존하는 역할을 한다.

3.3 3단계: CRISPR 배열의 전사

CRISPR 배열이 전사되면 긴 전구체 RNA인 pre-crRNA가 생성된다.

이후 RNA 가공을 통해 개별적인 crRNA가 형성된다.

3.4 4단계: Cas 단백질과 RNA의 결합

Type II CRISPR-Cas 시스템에서는 crRNA와 tracrRNA가 Cas9 단백질과 결합하여 기능성 복합체를 형성한다.

3.5 5단계: 외래 DNA의 인식과 절단

Cas9 복합체는 가이드 RNA와 상보적인 외래 DNA를 인식한다.

적절한 PAM 서열이 존재하면 Cas9이 표적 DNA를 절단하여 외래 유전물질의 기능을 억제할 수 있다.

이러한 과정은 CRISPR-Cas 시스템이 염기서열 정보를 이용하여 특정 외래 DNA를 선택적으로 인식하는 방어 체계임을 보여준다.

4. CRISPR-Cas9의 주요 구성 요소

유전체 편집에 이용되는 CRISPR-Cas9 시스템은 주로 Cas9 단백질과 가이드 RNA로 구성된다.

그러나 표적 DNA를 효율적으로 인식하고 절단하기 위해서는 PAM 서열도 필요하다.

4.1 Cas9 단백질

Cas9은 가이드 RNA와 결합하여 특정 DNA 염기서열을 인식하고 절단하는 핵산분해효소이다.

Cas9에는 DNA의 두 가닥을 각각 절단하는 촉매 도메인이 존재한다.

4.2 가이드 RNA

가이드 RNA는 Cas9이 인식할 표적 DNA의 위치를 결정하는 RNA이다.

가이드 RNA의 일부 염기서열은 표적 DNA와 상보적인 염기쌍을 형성한다.

4.3 PAM 서열

PAM(Protospacer Adjacent Motif)은 Cas9이 표적 DNA를 인식하는 데 필요한 짧은 DNA 서열이다.

PAM은 가이드 RNA의 일부가 아니라 표적 DNA에 존재하는 서열이다.

Cas9의 종류에 따라 필요한 PAM 서열은 달라진다.

5. Cas9 단백질의 전체 구조

가장 널리 연구되는 Cas9은 Streptococcus pyogenes에서 유래한 SpCas9이다.

SpCas9은 1,368개의 아미노산으로 구성된 단백질로, 크게 두 개의 구조적 영역으로 구분된다.

5.1 REC 영역(Recognition lobe)

REC 영역은 가이드 RNA 및 RNA-DNA 이중나선의 인식과 구조적 안정화에 관여한다.

대표적인 구성 요소에는 REC1, REC2, REC3 및 Bridge helix 등이 있다.

이 영역은 표적 DNA와 가이드 RNA 사이의 상보적 결합을 감지하고 Cas9의 구조 변화를 조절하는 데 중요하다.

5.2 NUC 영역(Nuclease lobe)

NUC 영역은 DNA 절단과 PAM 인식에 관여한다.

주요 구성 요소는 다음과 같다.

• HNH 핵산분해효소 도메인
• RuvC 핵산분해효소 도메인
• PAM 상호작용 도메인

이들 도메인은 서로 협력하여 표적 DNA를 인식하고 절단한다.

6. HNH 도메인의 구조와 기능

HNH 도메인은 Cas9에 존재하는 핵산분해효소 도메인 중 하나이다.

HNH 도메인은 가이드 RNA와 상보적인 DNA 가닥을 절단한다.

이 가닥을 표적 가닥(Target strand)이라고 한다.

6.1 표적 가닥의 인식

Cas9이 표적 DNA에 결합하면 가이드 RNA와 표적 DNA 가닥 사이에 RNA-DNA 이중나선이 형성된다.

이 과정에서 HNH 도메인은 절단 위치에 접근할 수 있도록 구조적으로 재배치된다.

6.2 DNA 절단

HNH 도메인은 DNA의 인산다이에스터 결합을 가수분해하여 표적 가닥을 절단한다.

이 반응에는 금속 이온이 관여한다.

6.3 HNH 도메인의 중요성

HNH 도메인은 단순히 DNA를 절단하는 역할뿐 아니라 Cas9의 표적 인식 정확성과 연결된 구조 변화에도 관여한다.

표적 DNA와 가이드 RNA 사이의 결합 상태가 적절하지 않으면 HNH 도메인의 활성화가 제한될 수 있다.

7. RuvC 도메인의 구조와 기능

RuvC 도메인은 HNH 도메인과 함께 DNA 이중가닥 절단에 관여하는 핵산분해효소 도메인이다.

RuvC는 가이드 RNA와 상보적으로 결합하지 않는 DNA 가닥을 절단한다.

이 가닥을 비표적 가닥(Non-target strand)이라고 한다.

7.1 RuvC 도메인의 특징

RuvC 도메인은 Cas9의 단백질 서열에서 떨어져 있는 여러 영역이 입체적으로 모여 형성된다.

대표적으로 RuvC-I, RuvC-II, RuvC-III 영역으로 구분할 수 있다.

7.2 비표적 가닥 절단

Cas9이 표적 DNA를 인식하고 구조 변화를 거치면 비표적 가닥이 RuvC 촉매 부위에 배치된다.

이후 RuvC가 DNA의 인산다이에스터 결합을 가수분해한다.

7.3 HNH와 RuvC의 협력

HNH와 RuvC는 DNA의 서로 다른 가닥을 절단한다.

• HNH: 가이드 RNA와 상보적인 표적 가닥 절단
• RuvC: 가이드 RNA와 상보적이지 않은 비표적 가닥 절단

두 도메인의 작용으로 DNA 이중가닥 절단(Double-strand break, DSB)이 형성된다.

8. crRNA와 tracrRNA의 구조와 기능

자연적인 Type II CRISPR-Cas9 시스템에서는 두 종류의 RNA가 Cas9의 작용에 관여한다.

8.1 crRNA

crRNA(CRISPR RNA)는 표적 DNA를 인식하는 데 필요한 염기서열 정보를 포함한다.

crRNA의 스페이서 유래 영역은 외래 DNA의 특정 서열과 상보적인 염기쌍을 형성한다.

따라서 crRNA는 Cas9이 어떤 DNA를 표적으로 인식할지 결정하는 역할을 한다.

8.2 tracrRNA

tracrRNA(Trans-activating CRISPR RNA)는 crRNA와 상보적인 영역을 통해 결합한다.

tracrRNA는 Cas9 복합체의 형성과 crRNA의 성숙 과정에 관여한다.

8.3 crRNA-tracrRNA 복합체

crRNA와 tracrRNA는 RNA-RNA 상보적 결합을 통해 기능성 복합체를 형성한다.

이 복합체가 Cas9과 결합하면 특정 DNA를 인식하고 절단할 수 있다.

9. sgRNA의 구조와 기능

sgRNA(Single-guide RNA)는 crRNA와 tracrRNA의 기능을 하나의 RNA 분자로 결합한 인공적인 가이드 RNA이다.

sgRNA는 일반적으로 표적 인식 영역과 Cas9 결합을 위한 구조적 영역으로 구성된다.

9.1 표적 인식 영역

표적 인식 영역은 일반적으로 약 20개의 뉴클레오타이드로 구성된다.

이 영역은 표적 DNA의 특정 서열과 상보적으로 결합한다.

9.2 Scaffold 영역

Scaffold 영역은 Cas9과 결합하는 데 필요한 RNA 구조를 형성한다.

이 영역에는 줄기-고리 구조 등이 포함된다.

9.3 sgRNA의 장점

sgRNA는 crRNA와 tracrRNA의 기능을 하나의 분자로 통합하므로 실험적으로 사용하기 편리하다.

표적 인식 영역의 염기서열을 변경하면 동일한 Cas9 단백질을 이용하여 서로 다른 DNA 영역을 표적으로 설정할 수 있다.

따라서 CRISPR-Cas9 기술의 표적 특이성은 주로 가이드 RNA의 염기서열과 PAM 조건에 의해 결정된다.

10. PAM 서열의 구조와 기능

PAM은 Cas9이 표적 DNA를 인식하는 데 필요한 짧은 염기서열이다.

가장 널리 사용되는 SpCas9의 대표적인 PAM은 5′-NGG-3′이다.

여기서 N은 A, T, G, C 중 어느 염기라도 가능하다는 의미이다.

따라서 NGG의 예에는 AGG, TGG, GGG, CGG가 있다.

10.1 PAM의 위치

PAM은 가이드 RNA가 인식하는 약 20 nt 표적 서열의 인접한 위치에 존재한다.

SpCas9의 전형적인 표적에서는 PAM이 프로토스페이서(Protospacer)의 3′ 쪽에 위치한다.

10.2 PAM의 역할

Cas9은 DNA에서 PAM 서열을 먼저 인식한다.

PAM이 인식되면 인접한 DNA 이중나선이 부분적으로 풀릴 수 있다.

이후 가이드 RNA가 표적 DNA와 상보적인 염기쌍을 형성한다.

10.3 PAM이 필요한 이유

Cas9은 단순히 가이드 RNA와 상보적인 DNA 서열이 존재한다는 이유만으로 모든 위치를 효율적으로 절단하지 않는다.

적절한 PAM의 존재가 표적 인식과 절단에 중요하다.

자연적인 CRISPR 면역 체계에서는 이러한 PAM 인식이 세균 자신의 CRISPR 배열과 외래 DNA를 구분하는 데 기여한다.

다만 Cas9의 종류와 변형체에 따라 PAM 인식 특성이 달라질 수 있다.

11. CRISPR-Cas9의 표적 DNA 인식 기작

11.1 1단계: Cas9과 가이드 RNA의 결합

Cas9 단백질이 가이드 RNA와 결합한다.

이 과정에서 Cas9의 구조가 변화하여 DNA를 인식할 수 있는 상태가 형성된다.

11.2 2단계: PAM 탐색

Cas9-가이드 RNA 복합체는 DNA와 상호작용하면서 적절한 PAM 서열을 탐색한다.

SpCas9은 대표적으로 NGG PAM을 인식한다.

11.3 3단계: DNA 이중나선의 부분적 분리

Cas9이 PAM을 인식하면 PAM 인접 영역의 DNA가 부분적으로 풀린다.

이 과정에서 가이드 RNA가 표적 DNA 가닥과 상보적인 염기쌍을 형성할 수 있게 된다.

11.4 4단계: Seed 영역의 상보성 검사

가이드 RNA의 PAM 인접 영역은 초기 표적 인식에서 중요한 역할을 한다.

이를 Seed 영역이라고 한다.

이 영역의 염기 불일치는 Cas9의 표적 인식과 절단 효율에 큰 영향을 줄 수 있다.

다만 Seed 영역의 정확한 범위와 불일치 허용 정도는 Cas9의 종류와 실험 조건에 따라 달라질 수 있다.

11.5 5단계: R-loop 형성

가이드 RNA가 표적 DNA 가닥과 결합하면 RNA-DNA 이중나선이 형성된다.

이때 반대쪽 DNA 가닥은 원래의 상보적 DNA 가닥과 분리된다.

이러한 구조를 R-loop라고 한다.

11.6 6단계: Cas9의 구조적 활성화

RNA-DNA 이중나선이 충분히 형성되면 Cas9의 구조가 변화한다.

특히 HNH 도메인의 재배치와 RuvC 도메인의 활성화가 DNA 절단에 중요하다.

12. CRISPR-Cas9의 DNA 절단 기작

Cas9은 표적 DNA를 인식한 이후 두 가닥을 절단한다.

12.1 HNH에 의한 표적 가닥 절단

HNH 도메인은 가이드 RNA와 상보적인 DNA 가닥의 인산다이에스터 결합을 절단한다.

12.2 RuvC에 의한 비표적 가닥 절단

RuvC 도메인은 가이드 RNA와 상보적이지 않은 DNA 가닥을 절단한다.

12.3 DNA 이중가닥 절단 형성

전형적인 SpCas9은 PAM으로부터 약 3 bp 상류에 해당하는 위치에서 DNA 이중가닥 절단을 형성한다.

일반적으로 거의 평활한 말단(Blunt end)이 형성되는 것으로 설명한다.

다만 실제 절단 말단의 구조는 Cas9의 종류와 반응 조건에 따라 차이가 나타날 수 있다.

12.4 절단 이후의 변화

Cas9에 의해 DNA가 절단되면 세포의 DNA 손상 반응과 복구 기작이 활성화될 수 있다.

이후 DNA가 어떤 방식으로 복구되는지에 따라 유전체 편집 결과가 달라진다.

13. CRISPR-Cas9과 DNA 복구 기작

CRISPR-Cas9은 특정 DNA 위치에 절단을 형성하는 역할을 한다.

그러나 실제 유전체의 염기서열 변화는 세포의 DNA 복구 과정에서 발생하는 경우가 많다.

대표적인 복구 경로에는 비상동 말단 연결과 상동성 의존 복구가 있다.

13.1 비상동 말단 연결(NHEJ)

NHEJ(Non-homologous end joining)는 DNA 이중가닥 절단 부위를 상동성 주형 없이 연결하는 대표적인 복구 기작이다.

NHEJ 과정에서는 DNA 말단의 처리에 따라 일부 염기가 제거되거나 추가될 수 있다.

그 결과 삽입 또는 결실(Insertion or deletion, Indel)이 발생할 수 있다.

다만 NHEJ가 항상 염기서열 오류를 만드는 것은 아니며, 정확하게 연결되는 경우도 있다.

13.2 상동성 의존 복구(HDR)

HDR(Homology-directed repair)은 상동성 DNA 서열을 이용하여 DNA 손상을 복구하는 경로이다.

유전체 편집에서는 원하는 염기서열을 포함한 공여 DNA(Donor DNA)를 제공하여 특정 변화를 유도할 수 있다.

HDR은 특정 염기서열의 교체나 삽입에 활용될 수 있다.

그러나 HDR의 효율은 세포주기, 세포 종류, 표적 위치 및 공여 DNA의 특성 등에 영향을 받는다.

14. NHEJ에 의한 유전자 녹아웃

유전자 녹아웃(Gene knockout)은 특정 유전자의 기능을 제거하거나 상실시키는 것을 의미한다.

CRISPR-Cas9에서는 NHEJ에 의한 삽입·결실을 이용하여 유전자 기능을 상실시키는 방법이 널리 사용된다.

14.1 1단계: 표적 유전자 절단

Cas9이 표적 유전자의 특정 DNA 위치를 절단한다.

14.2 2단계: NHEJ에 의한 복구

세포의 DNA 복구 기작이 절단된 DNA 말단을 다시 연결한다.

14.3 3단계: 삽입 또는 결실 발생

복구 과정에서 일부 염기가 삽입되거나 제거될 수 있다.

14.4 4단계: 읽기틀 변화

단백질 암호화 영역에서 3의 배수가 아닌 수의 염기가 삽입되거나 결실되면 읽기틀 이동(Frameshift)이 발생할 수 있다.

14.5 5단계: 유전자 기능 상실

읽기틀 이동으로 조기 종결 코돈이 생성되거나 단백질 구조가 변화하면 유전자 기능이 감소하거나 상실될 수 있다.

다만 모든 삽입·결실이 유전자 녹아웃을 유도하는 것은 아니다.

따라서 실제 유전자 녹아웃 여부는 DNA 염기서열과 단백질 발현 및 기능 분석을 통해 확인해야 한다.

15. HDR에 의한 유전자 교정

HDR은 특정 DNA 서열을 원하는 형태로 변화시키는 유전체 편집에 활용될 수 있다.

15.1 1단계: 표적 DNA 절단

Cas9이 원하는 위치에서 DNA 이중가닥 절단을 형성한다.

15.2 2단계: 공여 DNA 제공

연구자는 원하는 염기서열과 상동성 영역을 포함한 공여 DNA를 제공할 수 있다.

15.3 3단계: 상동성 서열 인식

세포의 DNA 복구 기구가 상동성 DNA 서열을 이용하여 절단 부위를 복구할 수 있다.

15.4 4단계: 원하는 염기서열 도입

공여 DNA의 정보를 이용하여 특정 염기서열의 교체 또는 삽입이 일어날 수 있다.

15.5 5단계: 편집 결과 확인

유전체 편집 이후에는 원하는 염기서열이 정확하게 도입되었는지 분석해야 한다.

HDR은 정밀한 유전체 편집에 유용하지만, 모든 세포에서 높은 효율로 발생하는 것은 아니다.

16. Cas9 변형체의 종류

Cas9의 촉매 도메인을 변형하면 DNA 절단 특성을 변화시킬 수 있다.

16.1 일반 Cas9

일반적인 Cas9은 HNH와 RuvC 도메인이 모두 활성화되어 있다.

따라서 표적 DNA의 두 가닥을 절단할 수 있다.

16.2 Nickase Cas9

Nickase Cas9(nCas9)은 HNH 또는 RuvC 도메인 중 하나의 촉매 활성을 불활성화한 변형체이다.

따라서 DNA 이중가닥 중 한 가닥만 절단한다.

대표적인 변형에는 D10A 또는 H840A 변이가 있다.

16.3 Dead Cas9

Dead Cas9(dCas9)은 HNH와 RuvC의 DNA 절단 활성이 모두 불활성화된 Cas9이다.

dCas9은 표적 DNA에 결합할 수 있지만 일반적인 DNA 절단 활성을 나타내지 않는다.

이러한 특징을 이용하여 특정 유전자의 전사 억제 또는 활성화를 유도할 수 있다.

17. CRISPRi와 CRISPRa의 원리

17.1 CRISPRi

CRISPR interference(CRISPRi)는 dCas9을 이용하여 특정 유전자의 전사를 억제하는 기술이다.

dCas9이 프로모터나 전사 관련 DNA 영역에 결합하면 RNA 중합효소의 결합 또는 이동을 방해할 수 있다.

또한 dCas9에 전사 억제 도메인을 결합시켜 유전자 발현을 감소시킬 수 있다.

17.2 CRISPRa

CRISPR activation(CRISPRa)은 dCas9에 전사 활성화 도메인을 결합하여 특정 유전자의 발현을 증가시키는 기술이다.

이러한 기술은 DNA 염기서열을 직접 절단하지 않고 유전자 발현량을 조절할 수 있다는 특징을 가진다.

18. 염기 교정(Base editing)의 원리

염기 교정은 특정 DNA 염기를 다른 염기로 전환하는 유전체 편집 기술이다.

일반적인 염기 교정 시스템은 Cas9 nickase 또는 dCas9과 염기 변형 효소를 결합하여 사용한다.

18.1 사이토신 염기 교정

Cytosine base editor(CBE)는 주로 C·G 염기쌍을 T·A 염기쌍으로 전환하는 데 사용된다.

이 과정에는 사이토신 탈아미노화효소 등이 관여한다.

18.2 아데닌 염기 교정

Adenine base editor(ABE)는 주로 A·T 염기쌍을 G·C 염기쌍으로 전환하는 데 사용된다.

이 과정에는 변형된 아데노신 탈아미노화효소가 관여한다.

18.3 염기 교정의 특징

염기 교정은 일반적인 Cas9에 의한 DNA 이중가닥 절단을 반드시 필요로 하지 않는다.

따라서 일부 상황에서는 이중가닥 절단에 따른 부작용을 줄일 수 있다.

다만 편집 가능한 염기의 종류와 위치에 제한이 있으며, 의도하지 않은 염기 변화가 발생할 가능성도 고려해야 한다.

19. 프라임 교정(Prime editing)의 원리

프라임 교정은 Cas9 nickase와 역전사효소(Reverse transcriptase)를 이용하여 특정 DNA 염기서열을 변화시키는 기술이다.

프라임 교정에는 일반적인 가이드 RNA보다 추가적인 정보를 포함하는 pegRNA(Prime editing guide RNA)가 사용된다.

19.1 pegRNA의 역할

pegRNA는 표적 DNA 인식에 필요한 서열뿐 아니라 원하는 편집 정보를 포함한다.

19.2 Cas9 nickase의 작용

Cas9 nickase는 표적 DNA의 한 가닥을 절단한다.

19.3 역전사효소의 작용

역전사효소는 pegRNA에 포함된 주형 정보를 이용하여 새로운 DNA 서열을 합성할 수 있다.

19.4 DNA 복구 및 편집

이후 세포의 DNA 처리 및 복구 기작을 통해 원하는 염기서열이 유전체에 반영될 수 있다.

프라임 교정은 특정 염기 치환과 작은 삽입·결실을 유도할 수 있다는 장점이 있다.

그러나 실제 편집 효율과 정확성은 표적 위치 및 세포 조건에 따라 달라진다.

20. CRISPR-Cas9의 오프타깃 효과

오프타깃 효과(Off-target effect)는 Cas9이 의도한 표적 DNA 이외의 위치에서 결합하거나 절단하는 현상을 의미한다.

20.1 오프타깃 효과의 발생 원인

가이드 RNA와 완전히 일치하지 않는 DNA 서열도 일정한 조건에서 Cas9에 의해 인식될 수 있다.

특히 표적 DNA와 유사한 염기서열이 유전체의 다른 위치에 존재하면 비표적 절단 가능성이 발생한다.

20.2 염기 불일치의 위치

가이드 RNA와 표적 DNA 사이의 불일치가 어느 위치에 존재하는지에 따라 Cas9의 절단 효율이 달라질 수 있다.

일반적으로 PAM 인접 Seed 영역의 불일치는 표적 인식에 큰 영향을 주는 경우가 많다.

그러나 PAM에서 멀리 떨어진 영역의 불일치는 일부 조건에서 허용될 수 있다.

20.3 오프타깃 효과의 문제점

의도하지 않은 DNA 절단은 다음과 같은 결과를 유발할 수 있다.

• 비표적 유전자에 삽입 또는 결실 발생
• 유전자 발현의 비정상적인 변화
• DNA 손상 반응 활성화
• 일부 조건에서 염색체 구조 변화

따라서 유전체 편집 실험에서는 표적 위치뿐 아니라 비표적 위치의 변화도 분석해야 한다.

21. CRISPR-Cas9의 정확성 향상 기술

21.1 High-fidelity Cas9

High-fidelity Cas9은 비표적 DNA에 대한 절단 가능성을 줄이도록 설계된 Cas9 변형체이다.

대표적으로 SpCas9-HF1, eSpCas9, HiFi Cas9 등의 변형체가 개발되었다.

21.2 가이드 RNA 최적화

가이드 RNA의 염기서열과 구조는 표적 인식 효율에 영향을 준다.

따라서 표적 유전체의 다른 위치와 유사성이 낮은 가이드 RNA를 선택하는 것이 중요하다.

21.3 Cas9 작용 시간 조절

Cas9이 세포 내에서 작용하는 시간과 양을 조절하면 일부 조건에서 비표적 절단 가능성을 줄일 수 있다.

21.4 유전체 편집 결과 분석

DNA 염기서열 분석과 다양한 유전체 분석 방법을 이용하여 표적 및 비표적 위치의 변화를 확인할 수 있다.

다만 오프타깃 효과가 감소했다고 해서 모든 유전체 편집 부작용이 사라지는 것은 아니다.

표적 위치에서 발생하는 큰 결실, 재배열 등도 별도로 고려해야 한다.

22. CRISPR-Cas9과 RNA 간섭의 차이

구분	CRISPR-Cas9	RNA 간섭(RNAi)
주요 표적	DNA	RNA
핵심 구성 요소	Cas9, 가이드 RNA	siRNA·miRNA, Argonaute
대표 작용	DNA 절단 및 편집	RNA 분해 및 번역 억제
DNA 염기서열 변화	발생할 수 있음	일반적으로 없음
대표 활용	유전자 녹아웃 및 정밀 편집	유전자 녹다운
효과 지속성	유전체 변형 시 장기적	전달 방식 등에 따라 다름

CRISPR-Cas9은 DNA 염기서열을 직접 변화시킬 수 있는 기술이다.

반면 RNA 간섭은 주로 RNA의 안정성이나 번역 효율을 변화시켜 유전자 발현을 억제한다.

따라서 두 기술은 유전자 기능 분석에 모두 활용되지만 작용 대상과 분자적 기작이 다르다.

23. CRISPR-Cas9의 의학적 활용

CRISPR-Cas9은 유전 질환의 원인이나 관련 유전자 발현을 변화시키는 치료 기술로 개발되고 있다.

23.1 겸상적혈구병

겸상적혈구병(Sickle cell disease)은 헤모글로빈 관련 유전자 변이에 의해 발생하는 유전성 혈액 질환이다.

CRISPR-Cas9 기반 치료 기술은 환자의 조혈모세포를 유전체 편집한 뒤 다시 투여하는 방식으로 활용될 수 있다.

23.2 β-지중해빈혈

β-지중해빈혈은 β-글로빈의 생성에 이상이 발생하는 유전성 혈액 질환이다.

일부 환자에서는 태아 헤모글로빈의 발현을 증가시키는 방식의 유전자 편집 치료가 적용될 수 있다.

23.3 CASGEVY

CASGEVY(Exagamglogene autotemcel)는 CRISPR-Cas9 기술을 이용하는 유전자 편집 세포 치료제이다.

이 치료제는 환자 자신의 조혈모세포를 채취하여 체외에서 유전체 편집한 뒤 다시 투여하는 방식으로 작용한다.

주요 표적은 BCL11A 유전자의 적혈구 계열 특이적 인핸서 영역이다.

해당 조절 영역을 편집하면 적혈구 계열에서 BCL11A 발현이 감소하고 태아 헤모글로빈(HbF)의 생성이 증가할 수 있다.

따라서 이 치료법은 HBB 유전자의 병적 변이를 직접 정상 염기서열로 교체하는 방식과 구분된다.

23.4 치료 기술의 한계

CRISPR-Cas9 기반 치료에는 다음과 같은 한계가 존재한다.

• 표적 조직으로의 전달 문제
• 비표적 DNA 절단 가능성
• 표적 위치에서의 예상하지 못한 DNA 변화
• 면역 반응과 치료 관련 부작용
• 장기적인 안전성 평가의 필요성

따라서 유전체 편집 기술의 치료적 활용에는 정확한 표적 선택과 충분한 안전성 검증이 중요하다.

24. CRISPR-Cas9의 생물학적 의의

CRISPR-Cas9은 유전체의 특정 DNA 서열을 선택적으로 조작할 수 있게 하여 분자생물학 연구의 범위를 크게 확장하였다.

특정 유전자를 제거하거나 변형한 뒤 나타나는 표현형을 분석하면 해당 유전자의 기능을 연구할 수 있다.

또한 특정 질환과 관련된 유전적 변이를 세포나 동물 모델에 도입하여 질환의 발생 기작을 연구할 수 있다.

CRISPRi와 CRISPRa는 DNA를 절단하지 않고 유전자 발현을 조절하는 연구에도 활용된다.

염기 교정과 프라임 교정은 기존의 DNA 이중가닥 절단 기반 편집 기술을 확장한 방법이다.

이러한 기술들은 유전자 기능 분석, 질환 모델 제작 및 정밀의학 연구에서 중요한 도구로 활용되고 있다.

25. 결론

CRISPR-Cas9은 가이드 RNA를 이용하여 특정 DNA 염기서열을 인식하고 절단하는 유전체 편집 시스템이다.

Cas9 단백질은 REC 영역과 NUC 영역으로 구성되며, HNH와 RuvC 도메인은 DNA의 서로 다른 가닥을 절단한다.

가이드 RNA는 표적 DNA의 염기서열을 인식하며, PAM은 Cas9의 초기 표적 인식에 중요한 역할을 한다.

Cas9이 표적 DNA를 인식하면 RNA-DNA 이중나선과 R-loop가 형성되고, 구조적 변화에 의해 DNA 절단 활성이 유도된다.

이후 세포의 NHEJ 또는 HDR 등의 DNA 복구 기작이 작용하여 유전체의 염기서열이 변화할 수 있다.

또한 Cas9 변형체를 이용하면 DNA 절단뿐 아니라 유전자 발현 조절, 염기 교정 및 프라임 교정 등 다양한 형태의 유전체 조작이 가능하다.

그러나 비표적 절단과 예상하지 못한 DNA 변화가 발생할 수 있으므로 정확성과 안전성에 대한 검증이 중요하다.

결국 CRISPR-Cas9은 RNA의 염기서열 정보를 이용하여 DNA를 선택적으로 인식하고, 세포의 DNA 복구 기작을 활용하여 유전체를 변화시키는 핵심적인 유전자 편집 기술이라고 할 수 있다.

26. 참고문헌(References)

1. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816–821.
   https://doi.org/10.1126/science.1225829
2. Jiang, F., & Doudna, J. A. (2017). CRISPR–Cas9 structures and mechanisms. Annual Review of Biophysics, 46, 505–529.
   https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-062215-010822
3. Hsu, P. D., Lander, E. S., & Zhang, F. (2014). Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 157(6), 1262–1278.
   https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.05.010
4. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., & Liu, D. R. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533, 420–424.
   https://doi.org/10.1038/nature17946
5. Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R., et al. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 576, 149–157.
   https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4
6. Pacesa, M., Lin, C.-H., Clery, A., et al. (2022). Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR–Cas9. Nature, 607, 168–175.
   https://doi.org/10.1038/s41586-022-04470-1